免疫层析技术作为快速诊断领域的核心方法，其核心原理依赖于标记抗体与目标抗原的特异性结合反应。标记抗体的用量直接影响检测的灵敏度、特异性及成本效益。

1、基本原理与标记抗体的作用

免疫层析基于抗原-抗体的特异性结合，以固相载体（如硝酸纤维素膜）为反应平台。标记抗体通常通过荧光素（如FITC）、酶（如HRP）、胶乳颗粒或量子点（QDs）等标记物进行功能化，以实现可视化或仪器化检测。

标记抗体的作用包括：

信号生成：通过酶促反应、荧光激发或胶乳聚集产生可检测信号；

定位识别：与目标抗原结合后，形成“检测线”或“对照线”复合物；

动态响应：在层析过程中随液体流动实现快速反应。

2、标记抗体用量过多的负面影响

1）非特异性结合增加，降低检测特异性

过量标记抗体易与固相载体或其他非目标蛋白发生非特异性吸附。例如：

抗体FC段干扰：小鼠单克隆抗体的FC段可能被类风湿因子（RF）或异嗜性抗体（如HAMA）识别，导致假阳性；

电荷吸附：硝酸纤维素膜表面带负电，过量抗体（尤其是带正电的标记物）可能通过静电作用非特异性结合，增加背景噪声。

在胶乳标记免疫层析中，过量抗体会导致胶乳颗粒在层析膜上非特异性聚集，形成假阳性条带。

2）信号过载与检测范围受限

标记抗体浓度过高可能引发信号过早饱和，具体表现为：

荧光猝灭：FITC标记时，单个抗体分子结合超过15-20个荧光素会因分子间能量转移导致荧光效率下降；

酶活性抑制：HRP标记抗体过量时，底物反应速率超出线性范围，无法准确反映低浓度抗原水平。

实验数据：研究表明，当FITC标记量超过20个/抗体分子时，荧光强度反而下降30%-50%。

3）流动效率降低

免疫层析依赖毛细作用推动液体流动，过量标记抗体可能：

堵塞膜孔径：大分子标记物（如胶乳颗粒）过量时，易在膜纤维中沉积，减缓层析速度；

竞争性结合：过量抗体会提前消耗反应体系中的抗原，导致检测线信号减弱甚至消失。

优化策略：通过透析法或凝胶层析（如葡聚糖G-25）去除未结合的游离标记物，可显著提升层析效率。

4）成本浪费与批次稳定性风险

标记效率下降：抗体与标记物的摩尔比需精确控制（如FITC标记推荐1:10-1:20）。过量标记不仅浪费昂贵试剂，还可能破坏抗体空间构象，降低结合活性；

批次间差异扩大：大规模生产中，过量标记会导致不同批次产品的信号强度波动，增加质控难度。

3、标记抗体用量技巧

1）标记方法的精准定量

荧光标记：通过Marshall直接法或透析法控制FITC与抗体的摩尔比，结合紫外分光光度计测定F/P值（荧光素/蛋白比），确保其介于1.5-2.5之间；

酶标记：采用棋盘滴定法确定HRP与抗体的最佳比例，通常以酶活性单位（U/mg）为指标。

2）层析介质与标记物的适配性优化

孔径匹配：选择孔径5-10μm的硝酸纤维素膜，避免胶乳或量子点颗粒（粒径200-500nm）堵塞；

表面修饰：对膜进行BSA或酪蛋白封闭，减少非特异性吸附。

3）智能化工艺控制

利用荧光偏振或表面等离子共振（SPR）实时监测标记效率。